大肠菌群平板计数验证方法教程：一线实验员大肠菌群能力比对实验实例分享

一、实验前期准备

1、检测项目：大肠菌群、大肠杆菌

2、检测方法选择：GB 4789.3和GB 4789.38

3、确认实验方案：把所涉及的试剂进行排查，查询是否缺某种试剂；根据检验标准，整理实验流程图，便于记录实验结果。

4、配置所需培养基：无菌生理盐水、月桂基硫酸盐胰蛋白胨、BGLB肉汤、EC肉汤、EMB琼脂、生化试剂等。

二、实验操作

1、收到样品后，确认样品包装是否完好，并将其保存在2~8℃冰箱中。

2、实验步骤

2.1、样品接种

方法选择和人员比对的探讨。根据对能力比对的样品的评估，尽量选择稀释度范围较大一些，样品稀释梯度到10-6，选择GB4789.3-2016中第一法《大肠菌群MPN计数法》；与此同时，选择快速纸片法做参考，纸片选取3M大肠菌群测试片进行测定。人员比对为两人。

2.2、进行实验

将样品从冰箱中取出达到室温后开启使用，在无菌室或生物安全柜下先用5mL稀释液（选取的生理盐水）进行水化后吸入无菌瓶或袋中，再用剩余的35mL稀释液进行洗涤并转入无菌瓶或袋中。

注：1、按照说明书，水化冻干粉收集共40mL混匀作为原液备用

2、开取西林瓶时，注意安全，以及观察能力比对样品状态是否完好。

2.2.1、再取25mL到225mL稀释液中均质混匀，制成10-1梯度样品匀液，稀释液手动混匀，混匀时注意观察是否有气泡产生。

2.2.2、用1mL无菌吸管取1:10的样液到9ml生理盐水试管中，制成1:100的样液，以此类推。再将几个稀释度的样液接种到LST肉汤中和3M测试片上。从样品的制备到接种全程应不超过15分钟，然后在36℃中培养，LST肉汤发酵管48h，测试片（按照说明书进行，我们用的是一张测试片即可测试大肠菌群又可以测试大肠杆菌的）培养24-48h。

2.2.3、在培养48h时观察发酵管产气情况，测试片的菌落生长情况并进行具体的菌落计数。

2.2.4、对LST肉汤发酵管中产气管进行复发酵证实实验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36℃±1 ℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。

（LST阳性图片）

（BGLE阳性结果图片）

3M测试片含有改良的VRB培养基，36 1℃培养24 2h，大肠菌群菌落为红色和蓝色的带气泡的菌落，36 1℃培养48 2h大肠杆菌为蓝色带气泡的菌落，计数范围15-150。

2.2.5、用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于已提前预温至45℃的EC肉汤管中，放入带盖的44.5℃±0.2℃水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h，检查小倒管内是否有气泡产生，如未有产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。

2.2.6、伊红美蓝平板分离培养

轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，36℃±1℃培养 18h～24h。观察平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

2.2.7、从每个平板上挑5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36℃±1℃，培养18h～24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。

三、结果报告

根据国标的结果上报数据为：大肠菌群为1100/mL,大肠杆菌为93/mL。最后收到能力比对结果为：满意。